FITC-乳糖标记的实验步骤是怎样的？

试剂和材料准备

• FITC：选择品质良好、纯度较高的异硫氰酸荧光素，一般可使用无水二甲基亚砜（DMSO）将其溶解配制成 1mg/ml 的溶液，且需现用现配，因为 FITC 在储存过程中可能会分解失效.

• 乳糖：将乳糖溶解在适当的缓冲液中，如 0.1M、pH 9.0 的碳酸钠缓冲液，配制成一定浓度的溶液，浓度可根据具体实验需求进行调整，但一般不宜过低，以保证有足够的乳糖参与反应.

标记反应

• 混合溶液：在避光条件下，将 FITC 溶液缓慢地逐滴加入到乳糖溶液中，边加边轻轻搅拌，使二者充分混合均匀 。一般每毫升乳糖溶液中可加入 50μl 的 FITC 溶液，但具体用量也可根据实验优化的结果进行调整.

• 反应条件：将混合后的溶液置于 4℃的黑暗环境中孵育反应，反应时间通常为 8 小时左右，但为了确定最佳反应时间，可设置不同的时间梯度进行预实验，如 4 小时、6 小时、8 小时、10 小时等，以找到标记效率较高的反应时间.

反应终止与纯化

• 终止反应：向反应体系中加入适量的氯化铵，使其终浓度达到 50mM，以终止 FITC 与乳糖的反应，然后在 4℃下继续孵育 2 小时.

• 去除杂质：反应终止后，可采用透析法或凝胶过滤色谱法等对标记产物进行纯化，以去除未反应的 FITC、乳糖以及其他杂质。透析时可选择合适截留分子量的透析袋，在适当的缓冲液中进行透析；凝胶过滤色谱则可根据分子大小的差异将标记产物与杂质分离开来.

产物鉴定与检测

• 荧光检测：使用荧光光谱仪对纯化后的 FITC - 乳糖产物进行荧光检测，激发波长一般为 490 - 495nm，发射波长为 515 - 525nm，观察其荧光强度和光谱特征是否符合预期，以确定标记是否成功以及标记效率的高低.

• 其他检测：还可结合其他分析方法，如高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）等对标记产物的纯度、结构等进行进一步的鉴定和分析，以确保获得高质量的 FITC - 乳糖标记产物.

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