荧光素标记血红蛋白的实验步骤

试剂和材料准备

• 血红蛋白溶液：可以从血液中分离提取血红蛋白，也可购买商品化的血红蛋白产品，用合适的缓冲液将其溶解并调整至合适的浓度，一般浓度不小于 0.5mg/mL。

• 荧光素：如异硫氰酸荧光素（FITC），使用无水 DMSO 配制 10mM 的染料溶液，剩余染料溶液可在 - 20℃分装保存 1 个月。如果是水溶解，染料有易被水解的性质，建议现配现用。

• 缓冲液：如 pH 8-9 的碳酸盐缓冲液或 pH 8.2 的磷酸盐缓冲液。

标记反应

• 取一定量的血红蛋白溶液置于合适的容器中，如比色管或离心管。

• 加入适量的缓冲液，使反应体系处于适宜的 pH 和离子强度环境。

• 按照一定的摩尔比缓慢滴加荧光素溶液，染料与蛋白的摩尔比通常在 5:1-20:1，边滴加边搅拌或轻轻振荡，使反应充分混合。

• 将反应容器置于一定的温度条件下孵育，如 4℃反应 12 小时或室温下反应 2 小时等。

纯化与分离

• 反应结束后，需要通过透析或者凝胶过滤等方法除去未反应的荧光素。透析时，将反应后的溶液装入透析袋中，在大量的缓冲液中透析数小时至过夜，期间更换缓冲液数次，以去除未结合的荧光素。凝胶过滤可以使用葡聚糖凝胶等填料，将反应混合物上样到凝胶柱上，用缓冲液洗脱，收集标记的血红蛋白峰。

检测与鉴定

• 荧光显微镜观察：取少量标记后的血红蛋白溶液，滴在载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察，选择与荧光素激发和发射波长匹配的滤光片，看是否有明显的荧光信号，并且观察荧光的分布情况，判断标记是否成功。

• 蛋白电泳实验：进行蛋白电泳，标记后蛋白本身分子量会增大，若蛋白存在微小向上拖带可以证明标记成功。如果向下大范围拖带可能是蛋白发生降解。

• 分光光度计测定：使用分光光度计测定荧光素和血红蛋白的比值（F/P），F/P 的比值反映荧光蛋白的特异性染色质量，一般要求 F/P 的克分子比值为 1～3。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，标记效率低。

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