胆钙化醇-鸡卵清白蛋白偶联物的制备方法有哪些


胆钙化醇-鸡卵清白蛋白偶联物的制备方法主要有以下几种:
过碘酸盐氧化法
原理:过碘酸钠将辣根过氧化物酶(HRP)分子表面的多糖氧化为醛基,醛基与胆钙化醇分子上的氨基形成Schiff碱而结合,后者可进一步用NaBH₄(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记物。
操作步骤:
将HRP溶解在适量的缓冲溶液中,加入过碘酸钠溶液,在一定温度下避光反应一段时间,使HRP表面的多糖被氧化为醛基。
将胆钙化醇溶解在合适的有机溶剂中,加入到上述氧化后的HRP溶液中,在碱性条件下反应,使醛基与胆钙化醇的氨基形成Schiff碱。
加入NaBH₄溶液,在一定温度下反应一段时间,将Schiff碱还原为稳定的共价键,得到胆钙化醇-过氧化物酶标记物。
对反应产物进行透析或超滤等纯化操作,去除未反应的小分子物质,得到纯化的标记物。
戊二醛交联法
原理:戊二醛作为双功能交联剂,可与HRP和胆钙化醇分子上的氨基反应,形成稳定的交联产物。
操作步骤:
将HRP和胆钙化醇分别溶解在适当的缓冲溶液中。
向HRP溶液中加入适量的戊二醛溶液,在一定温度下反应一段时间,使HRP分子上的氨基与戊二醛的醛基反应。
将上述反应液与胆钙化醇溶液混合,在一定温度下继续反应,使戊二醛的另一个醛基与胆钙化醇分子上的氨基反应,形成交联产物。
对反应产物进行透析或超滤等纯化操作,去除未反应的戊二醛和其他小分子物质,得到纯化的胆钙化醇-过氧化物酶标记物。
其他方法
直接偶联法:利用某些化学试剂或酶促反应,将胆钙化醇直接与HRP进行偶联。例如,使用N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等活化试剂,将胆钙化醇活化后与HRP分子上的氨基反应,形成稳定的偶联物。
间接偶联法:通过引入中间连接分子,如生物素-亲和素系统,将胆钙化醇与HRP间接偶联。首先将胆钙化醇与生物素结合,然后利用亲和素与生物素的特异性结合,将亲和素标记的HRP与生物素化的胆钙化醇结合,形成标记物。
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