牛血清蛋白偶联黄体酮的制备方法有哪些

以下是牛血清蛋白偶联黄体酮的几种常见制备方法：

活泼酯法

• 原理：先将黄体酮进行化学修饰，引入羧基等活性基团，然后与牛血清蛋白上的氨基通过活泼酯反应形成酰胺键，实现偶联。

• 步骤：将黄体酮半抗原溶解于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，再分别将N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于DMF，使三者的摩尔比为1:2:2。室温下，磁力搅拌器搅拌12～16小时，转速为250～300rpm，使半抗原上的羧基充分活化。冰浴下，缓慢搅拌，逐渐滴加活化的半抗原到5～7mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）中，使DMF在溶液的最终浓度为20～25％。低温下缓慢搅拌偶联12～16小时，将半抗原和载体蛋白的偶联物装入透析袋中，4℃下透析三天，一天换3次PBS（0.01M；pH 7.4）除去多余的DMF。最后，10,000～12,000rpm，4℃下离心10min，弃沉淀，取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒测量浓度，分装于EP管中，储存于-20℃备用。

碳二亚胺法

• 原理：碳二亚胺类化合物作为脱水剂，促进羧基和氨基之间形成酰胺键。可替宁分子中存在羧基等活性基团，牛血清蛋白上有丰富的氨基，利用碳二亚胺使两者发生缩合反应，从而实现偶联。

• 步骤：首先将可替宁和牛血清蛋白分别溶解在合适的缓冲液中，然后将碳二亚胺试剂（如EDC，即1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）加入到可替宁溶液中，活化一段时间后，将活化后的可替宁溶液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，在一定的温度和pH条件下搅拌反应数小时。反应结束后，通过透析或凝胶过滤等方法去除未反应的物质和杂质，得到可替宁-牛血清蛋白共轭物。

戊二醛法

• 原理：戊二醛是一种双功能交联剂，能够与蛋白质分子中的氨基发生反应，形成席夫碱结构，从而将两个蛋白质分子连接起来。

• 步骤：把牛血清蛋白溶解在缓冲液中，加入适量的戊二醛溶液，在一定温度下搅拌反应一段时间，使牛血清蛋白分子之间发生轻度交联，这样可以增加蛋白的反应活性位点。然后将可替宁加入到上述反应体系中，继续在适宜的条件下反应数小时。反应完成后，同样需要进行纯化处理，以获得纯净的共轭物。

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