恩诺沙星-过氧化物酶标记物的制备方法有哪些

恩诺沙星-过氧化物酶标记物的制备方法主要有以下几种：

戊二醛法

• 原理：戊二醛作为双功能交联剂，能与过氧化物酶和恩诺沙星的氨基结合，形成稳定的标记物。

• 操作步骤：

• 将恩诺沙星和过氧化物酶分别溶解于适当的缓冲液中，如0.01mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液。

• 按一定比例混合恩诺沙星和过氧化物酶溶液，加入适量的戊二醛，使戊二醛的终浓度为0.1%-0.5%。

• 室温下搅拌反应2-4小时，或4℃过夜。

• 反应结束后，用透析袋对0.01mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液透析，去除未反应的戊二醛和其他小分子杂质。

• 透析后的标记物可加入适量的甘油，分装后于-20℃保存。

过碘酸钠法

• 原理：过碘酸钠可将过氧化物酶的糖基氧化成醛基，醛基与恩诺沙星的氨基结合形成Schiff氏碱，再用硼氢化na还原稳定。

• 操作步骤：

• 溶解过氧化物酶于0.1mol/L NaHCO3溶液中，加入新配制的0.1mol/L NaIO4溶液，室温避光反应20-30分钟。

• 反应后的溶液装入透析袋，对0.001mol/L pH 4.0的醋酸缓冲液透析过夜，期间更换透析液几次。

• 将恩诺沙星用0.01mol/L碳酸缓冲液稀释至一定浓度，并用0.01mol/L碳酸缓冲液将活化好的过氧化物酶溶液pH调至9.5左右。

• 将恩诺沙星溶液加入过氧化物酶溶液中，室温或4℃反应2小时。

• 加入新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，室温作用30分钟，再加入适量NaBH4溶液，室温或4℃过夜。

• 最后对0.01mol/L PBS透析过夜，加入保存液于-20℃保存。

改良过碘酸盐氧化法

• 原理：与过碘酸钠法类似，也是通过过碘酸盐氧化过氧化物酶，使其产生醛基，然后与恩诺沙星的氨基结合，形成稳定的标记物。

• 操作步骤：

• 溶解过氧化物酶于超纯水中，加入新配制的0.1mol/L多碘酸钠，室温或4℃冰箱反应20-30分钟。

• 反应完后装入透析袋，对0.001mol/L pH 4.0的醋酸缓冲液透析过夜，期间更换透析液几次。

• 将恩诺沙星用0.01mol/L碳酸缓冲液稀释至一定浓度，并用0.01mol/L碳酸缓冲液将活化好的过氧化物酶溶液pH调至9.5左右。

• 将恩诺沙星溶液加入过氧化物酶溶液中，室温或4℃反应2小时。

• 加入新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，室温作用30分钟，再加入适量NaBH4溶液，室温或4℃过夜。

• 最后对0.01mol/L PBS透析过夜，加入保存液于-20℃保存。

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