柠檬黄-过氧化物酶标记物的制备方法有哪些

柠檬黄-过氧化物酶标记物的制备方法主要有以下几种：

过碘酸钠法

• 原理：辣根过氧化物酶（HRP）的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化na稳定Schiff氏碱。

• 操作步骤：

• 将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。

• 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。

• 加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。

• 称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。

• 用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。

• 将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集。

改良过碘酸盐氧化法

• 原理：通过过碘酸盐氧化HRP，使其产生醛基，然后与柠檬黄特异性抗体的氨基结合，形成稳定的标记物。

• 操作步骤：

• 溶解5mg HRP于1ml超纯水中，加入新配制的0.1mol/L多碘酸钠75μL，置室温或4℃冰箱反应20分钟或30分钟。

• 反应完后装入透析袋，0.001mol/L pH＝4.0醋酸缓冲液4℃透析过夜，期间需要更换透析液几次。

• 将抗体用0.01mol/L碳酸缓冲液稀释至10mg/mL，另外用0.01mol/L碳酸缓冲液将活化好的HRP的溶液pH调至9.5。将0.5ml抗体加入HRP溶液中，置室温或4℃冰箱反应2小时。

• 加入100μL 4mg/mL硼氢化na，4℃冰箱反应2小时。

• 对0.01mol/L PBS透析过夜，加入保存液-20℃保藏备用。

戊二醛法

• 原理：戊二醛作为双功能交联剂，能与HRP和抗体的氨基结合，形成稳定的标记物。

• 操作步骤：

• 将5mg AKP加入1ml抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时，换液三次。

• 加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。

• 换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。

• 取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AKP标记物原液。

• 每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。

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